Prematurity epigenome and proteome as a clue for
prediction of prematurity complications
NEOMICS – nr projektu 196065
wersja angielska

Aktualności

 


Aktualności - Eksperyment na modelu zwierzęcym

Postępy projektu NEOMICS – Instytut Badań w Pediatrii, Szpital Uniwersytecki Rikshospitalet, Oslo, Norwegia

W 2013 roku w Instytucie Badań w Pediatrii, w Uniwersyteckim Szpitalu Rickhospitalet w Oslo w Norwegii, kierowanym przez profesora Ola Didrika Saugstada, w celu realizacji projektu NEOMICS, dwie nowe osoby uzyskały uprawnienia do przeprowadzania badań na zwierzętach.

Pierwszą częścią projektu było stworzenie mysiego modelu dysplazji oskrzelowo-płucnej (BPD). Po uzyskaniu pozytywnej opinii Norweskiego Urzędu Badań na Zwierzętach, w maju i czerwcu 2014 roku przeprowadzono badanie pilotażowe, a do końca listopada 2014 roku zakończono badanie główne. Noworodki mysie, odpowiadające noworodkom ludzkim urodzonym przedwcześnie, przydzielono losowo tuż po urodzeniu do grupy normoksji (21 % tlenu) lub hiperoksji (85% tlenu), a następnie podzielono na grupy otrzymujące lub nie otrzymujące leczenia deksametazonem, co stanowiło symulację stosowania glikokortykosteroidów w okresie poporodowym u nowordków. Myszy przebywały w warunkach hiperoksji lub normoksji przez 14 dni. Kolejne 14 dni spędziły z matkami i rodzeństwem oddychając powietrzem atmosferycznym. W 28 dniu życia pobrano próbki tkanek (z krwi i płuc). Przygotowano również preparaty mikroskopowe z dotkniętych dysplazją płuc w celu weryfikacji modelu. Korzystając ze specjalnej metody obliczeniowej sprawdzono wiarygodność modelu stwierdzając obecność istotnych statystycznie różnic pomiędzy kontrolą i dotkniętymi dysplazją oskrzelowo-płucną płucami. Raport dotyczący dotychczas uzyskanych wyników zostanie wygłoszony na konferencji „The 30th International Workshop on Surfactant Replacement”, w Sztokholmie, w Szwecji, w dniach 5-6 lipca 2015 roku. Uzyskane próbki tkanek zostały wysłane do Zakładu Genetyki Medycznej, Polsko-Amerykańskiego Instytutu Pediatrii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Uzyskane wyniki badań ekspresji mRNA z krwi są aktualnie przedmiotem analizy statystycznej.

Drugą częścią badań na zwierzętach było przygotowanie mysiego modelu retinopatii wcześniaków (ROP). W listopadzie i grudniu 2014 roku przeprowadzono z sukcesem badanie pilotażowe. Tygodniowe noworodki mysie poddawano działaniu 75% tlenu przez 5 dni, grupa kontrolna pozostała w warunkach normoksji. W uzyskanych siatkówkach oszacowano ekspresję mRNA po ekspozycji na wysokie stężenie tlenu. W maju i czerwcu 2015 roku przeprowadzone zostanie główne badanie ROP.

Przygotowane mysie modele chorób zależnych od nadmiernych stężeń tlenu u noworodków (w naszym przypadku BPD i ROP) będą mogły być używane przez innych badaczy do dalszych eksperymentów.

 


Aktualności z laboratorium genetycznego

Stan realizacji projektu “Prematurity epigenome and proteome as a clue for prediction of prematurity complications” - maj 2015

Zakończono prace związane z modelem mysim dysplazji oskrzelowo-płucnej (BPD) prowadzone w Department of Pediatric Research, Rikshospitalet, University of Oslo, Norwegia.

Analiza ekspresji genomu techniką mikromacierzy
w Zakładzie Genetyki Medycznej
Katedry Pediatrii UJ CM.
(Fot. Anna Madetko-Talowska)


W Zakładzie Genetyki Medycznej Katedry Pediatrii UJ CM przeprowadzono analizę ekspresji mysiego genomu w z wykorzystaniem techniki mikromacierzy. W chwili obecnej wyniki poddawane są analizie statystycznej w Microarray Core Facility, University of Oslo. Zespół badaczy pod kierunkiem prof. Ola D. Saugstada rozpoczął także prace nad modelem mysim retinopatii wcześniaczej – ROP.

Na Oddziale Patologii i Intensywnej Terapii Noworodka Kliniki Chorób Dzieci Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego trwa rekrutacja pacjentów: noworodków urodzonych przed 30 tygodniem ciąży. Od każdego uczestnika badania zabezpieczany jest materiał genetyczny w postaci próbek DNA, RNA oraz wykonywany jest eksperyment hodowli leukocytów krwi obwodowej in vitro w zróżnicowanych warunkach tlenowych. W chwili obecnej rozpoczynają się prace eksperymentalne dotyczące analizy ekspresji genomu ludzkiego techniką mikromacierzy w Zakładzie Genetyki Medycznej Katedry Pediatrii UJ CM oraz analizy proteomu w OMICRON UJ CM.

 


Aktualności z laboratorium proteomicznego

Postępy w projekcie

Podstawowym zadanie w trakcie pierwszego roku realizacji projektu była optymalizacja istniejących protokołów badawczych do analizy materiału klinicznego będącego przedmiotem badań grantu (tj. osocza i lizatów komórkowych). Metodologia przygotowania próbek została dopasowana do potrzeb projektu w celu maksymalizacji ilości uzyskanych informacji dla możliwie najdokładniejszej i najczulszej analizy ilościowej metodą iTRAQ. W pierwszym kroku zmodyfikowano protokół wzbogacania próbek osocza w białka o niskiej ekspresji z zastosowaniem kombinatorycznych bibliotek ligandów heksapeptydowych (CPLL), zwiększając wydajność wiązania i elucji białek. Następnie zoptymalizowano warunki frakcjonowania, chromatograficznej separacji peptydów i ich analizy za pomocą spektrometrii mas, dla uzyskania możliwe największej czułości i powtarzalności rozdziałów przy minimalizacji czasu analiz. Pożądane parametry zostały spełnione po rozdziale mieszanin znakowanych peptydów na 12 frakcji (frakcjonowanie na silnym wymieniaczu kationów, SCX) i ich dalszej analizie systemem LC-MS. W chwili obecnej zdolność do stabilnej kwantyfikacji białek osocza sięga ok. 160 białek. Na koniec zoptymalizowano protokół lizy, oczyszczania i trawienia białek lizatów komórek jednojądrzastych krwi (BMC) poprzez dodanie to istniejącego protokołu szeregu dodatkowych kroków (m.in. dodatkowa sonikacja i redukcja białek w wysokiej temperaturze). W chwili obecnej zdolność do stabilnej kwantyfikacji białek lizatów komórek jednojądrzastych krwi przekracza 400 białek.

 


--- Powrót ---

 



Kontakt:

Katedra Pediatrii, Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii
Wydział Lekarski UJ CM

30-663 Kraków, ul. Wielicka 265
tel. (4812) 658 02 56
fax (4812) 658 44 46
e-mail: klinchdz@cm-uj.krakow.pl

Kierownik projektu:
prof. dr hab. med. Jacek Józef Pietrzyk
Projekt współfinansowany ze środków funduszy norweskich, w ramach programu Polsko – Norweska Współpraca Badawcza
realizowanego przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju.